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液相色譜柱安裝與使用說(shuō)明
更新時(shí)間：2012-12-25 瀏覽次數(shù)：5202
液相色譜柱安裝與使用說(shuō)明
液相色譜儀由高壓液體泵、檢測(cè)器及液相色譜柱等三部分組成，其中液相色譜柱的正確安裝和使用，是液相色譜工作的關(guān)鍵；也是液相色譜工作者獲得正確可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的必經(jīng)之路。
一、液相色譜柱的安裝：
1、液相色譜柱的結(jié)構(gòu)：
a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。
柱接頭采用低死體積結(jié)構(gòu)，柱接頭是兩端螺紋組件，一端是為7/16英寸外螺紋，另一端是3／16英寸的內(nèi)螺紋（國(guó)內(nèi)外已規(guī)范化）。7／16英寸外螺紋與1／4英寸柱管（Φ6.35mm）連接，中間放置壓壞用于密封。3／16英寸的內(nèi)螺紋與1／16英寸（Φ1.57mm）的連接管連接，中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封。為了盡量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時(shí)，用Φ1.57mm連接管通過(guò)空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底，然后再擰緊空心螺釘。壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上（連接管通過(guò)壓環(huán)后露出的管長(zhǎng)度應(yīng)嚴(yán)格控制在2．5mm長(zhǎng)或其他固定尺寸）。
在兩端柱接頭內(nèi)，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片（或?yàn)V網(wǎng)），用于封堵柱填料不被流動(dòng)相沖出柱外而流失?？罩鹘M件均為316#不銹鋼材質(zhì)，能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性，故使用時(shí)要注意，柱及連接管內(nèi)不能長(zhǎng)時(shí)間存留此類溶劑，以避免腐蝕。
b、柱填料：
液相色譜柱的分離作用是在填料與流動(dòng)相之間進(jìn)行的，柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。
正相柱：多以硅膠為柱填料。根據(jù)外型可分為無(wú)定型和球型兩種，其顆粒直徑在3—10 µm的范圍內(nèi)。另一類正相填料是硅膠表面鍵合—CN，-NH2等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠。
反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán)（ODS）的非極性填料。也有無(wú)定型和球型之分。
常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒粒徑在3—10 µm之間。
2，色譜柱的安裝：
a、拆開柱包裝盒，確認(rèn)色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內(nèi)貯存的溶劑。
b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。
c、 按柱管上標(biāo)示的流動(dòng)相流向，將色譜柱的入口端通過(guò)連接管與進(jìn)樣閥出口相連接（如條件允許，建議在柱前使用保護(hù)柱）；柱的出口與檢測(cè)器連接。連接管是外徑為1.57mm、內(nèi)徑為0.1-0.3mm的不銹鋼管。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。在接管時(shí)一定要設(shè)法降低柱外死體積。連接管通過(guò)空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底，然后順時(shí)針擰緊空心螺釘，直到擰不動(dòng)為止，再用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰1／4-1／2圈，切記不要用力過(guò)大。如色譜柱通過(guò)流動(dòng)相加壓后有漏液現(xiàn)象，請(qǐng)用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰1／4圈，直至不漏液為止。
二、液相色譜柱的使用：
色譜柱在使用前，進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來(lái)，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測(cè)試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行（出廠測(cè)試所使用的條件是*條件），只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。
1、樣品的前處理：
a、使用流動(dòng)相溶解樣品。
b、使用予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。c、使用0.45µm的過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì)。
2、流動(dòng)相的配制：
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：
a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中（或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中）。
b、流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)（特殊情況除外）。
c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長(zhǎng)的分析柱時(shí)能得到好的分離效果；同時(shí)降低柱壓降，延長(zhǎng)液體泵的使用壽命（可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度）。
d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器，使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。
e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行。
f、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3、流動(dòng)相流速的選擇：
因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求*柱效，使用*流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。
當(dāng)選用*流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(zhǎng)?？刹捎酶淖兞鲃?dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間（如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量）。
注意：
1．由于甲醇廉價(jià)，對(duì)于反相柱推薦使用甲醇體系（必須使用乙腈的場(chǎng)合除外）。
2．對(duì)于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動(dòng)相，沒(méi)有提純的己烷不得使用。用水使用超純水（電阻率大于18兆歐），去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果。
3．含水流動(dòng)相zui奸在實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過(guò)夜。加入*，防止細(xì)菌生長(zhǎng)。
4．流動(dòng)相要求使用0.45 µm濾膜過(guò)濾，除去微粒雜質(zhì)。
5．使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，提高柱性能。
4、柱性能測(cè)試：
——啟動(dòng)液相色譜儀：a、流動(dòng)相流速設(shè)定為1ml／min。
b、UV檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)定為254nm。
——使用出廠測(cè)試時(shí)使用的流動(dòng)相組成及測(cè)試樣品。
——記錄并計(jì)算測(cè)試結(jié)果。
*參考（標(biāo)準(zhǔn)JB5226-91）液相色譜儀測(cè)試用標(biāo)準(zhǔn)色譜柱。
一、液相色譜柱的安裝：
1、液相色譜柱的結(jié)構(gòu)：
a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。
柱接頭采用低死體積結(jié)構(gòu)，柱接頭是兩端螺紋組件，一端是為7/16英寸外螺紋，另一端是3／16英寸的內(nèi)螺紋（國(guó)內(nèi)外已規(guī)范化）。7／16英寸外螺紋與1／4英寸柱管（Φ6.35mm）連接，中間放置壓壞用于密封。3／16英寸的內(nèi)螺紋與1／16英寸（Φ1.57mm）的連接管連接，中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封。為了盡量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時(shí)，用Φ1.57mm連接管通過(guò)空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底，然后再擰緊空心螺釘。壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上（連接管通過(guò)壓環(huán)后露出的管長(zhǎng)度應(yīng)嚴(yán)格控制在2．5mm長(zhǎng)或其他固定尺寸）。
在兩端柱接頭內(nèi)，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片（或?yàn)V網(wǎng)），用于封堵柱填料不被流動(dòng)相沖出柱外而流失?？罩鹘M件均為316#不銹鋼材質(zhì)，能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性，故使用時(shí)要注意，柱及連接管內(nèi)不能長(zhǎng)時(shí)間存留此類溶劑，以避免腐蝕。
b、柱填料：
液相色譜柱的分離作用是在填料與流動(dòng)相之間進(jìn)行的，柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。
正相柱：多以硅膠為柱填料。根據(jù)外型可分為無(wú)定型和球型兩種，其顆粒直徑在3—10 µm的范圍內(nèi)。另一類正相填料是硅膠表面鍵合—CN，-NH2等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠。
反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán)（ODS）的非極性填料。也有無(wú)定型和球型之分。
常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒粒徑在3—10 µm之間。
2，色譜柱的安裝：
a、拆開柱包裝盒，確認(rèn)色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內(nèi)貯存的溶劑。
b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。
c、 按柱管上標(biāo)示的流動(dòng)相流向，將色譜柱的入口端通過(guò)連接管與進(jìn)樣閥出口相連接（如條件允許，建議在柱前使用保護(hù)柱）；柱的出口與檢測(cè)器連接。連接管是外徑為1.57mm、內(nèi)徑為0.1-0.3mm的不銹鋼管。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。在接管時(shí)一定要設(shè)法降低柱外死體積。連接管通過(guò)空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底，然后順時(shí)針擰緊空心螺釘，直到擰不動(dòng)為止，再用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰1／4-1／2圈，切記不要用力過(guò)大。如色譜柱通過(guò)流動(dòng)相加壓后有漏液現(xiàn)象，請(qǐng)用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰1／4圈，直至不漏液為止。
二、液相色譜柱的使用：
色譜柱在使用前，進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來(lái)，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測(cè)試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行（出廠測(cè)試所使用的條件是*條件），只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。
1、樣品的前處理：
a、使用流動(dòng)相溶解樣品。
b、使用予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。c、使用0.45µm的過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì)。
2、流動(dòng)相的配制：
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：
a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中（或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中）。
b、流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)（特殊情況除外）。
c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長(zhǎng)的分析柱時(shí)能得到好的分離效果；同時(shí)降低柱壓降，延長(zhǎng)液體泵的使用壽命（可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度）。
d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器，使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。
e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行。
f、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3、流動(dòng)相流速的選擇：
因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求*柱效，使用*流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。
當(dāng)選用*流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(zhǎng)?？刹捎酶淖兞鲃?dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間（如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量）。
注意：
1．由于甲醇廉價(jià)，對(duì)于反相柱推薦使用甲醇體系（必須使用乙腈的場(chǎng)合除外）。
2．對(duì)于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動(dòng)相，沒(méi)有提純的己烷不得使用。用水使用超純水（電阻率大于18兆歐），去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果。
3．含水流動(dòng)相zui奸在實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過(guò)夜。加入*，防止細(xì)菌生長(zhǎng)。
4．流動(dòng)相要求使用0.45 µm濾膜過(guò)濾，除去微粒雜質(zhì)。
5．使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，提高柱性能。
4、柱性能測(cè)試：
——啟動(dòng)液相色譜儀：a、流動(dòng)相流速設(shè)定為1ml／min。
b、UV檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)定為254nm。
——使用出廠測(cè)試時(shí)使用的流動(dòng)相組成及測(cè)試樣品。
——記錄并計(jì)算測(cè)試結(jié)果。
*參考（標(biāo)準(zhǔn)JB5226-91）液相色譜儀測(cè)試用標(biāo)準(zhǔn)色譜柱。
| 常見故障及排除 | | | |||
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| | 柱壓升高 | 色譜柱入U(xiǎn)濾片被流動(dòng)相或樣品中顆粒堵住。 樣品組分在濾片上沉淀堵住濾片。 | 卸下入口接頭的濾片，使用1：1的硝酸溶液超聲清洗5min，再用水、 甲醇清洗除去水份。 樣品及流動(dòng)相使用0．45µm濾膜除去微量雜質(zhì)。 使用流動(dòng)相作溶劑配制樣品。 | | |
| | 新柱柱效低 | 柱外死體積大。 樣品在流動(dòng)相中溶解不好，影響傳質(zhì)過(guò)程。 | 更換連接管，重新連接色譜柱，降低死體積。 使用合適的流動(dòng)相或使用流動(dòng)相溶解樣品。 | | |
| | 舊色譜柱柱效低，分離不好，柱入口床層塌陷。 | 填料被流動(dòng)相溶蝕而流失。 | 用同型填料填補(bǔ)柱效可部分恢復(fù)。 對(duì)硅膠質(zhì)填料，流動(dòng)相PH值在2—7范圍內(nèi)，否則可能被溶蝕。 | | |
| | 舊色譜柱柱效低分離不好，有時(shí)出現(xiàn)雙峰。 | 入門填料被污染變質(zhì)所致。 | 用強(qiáng)溶劑沖洗。 刮除被污染的床層，用同型的填料填補(bǔ)柱效可部分恢復(fù)。 污染嚴(yán)重，則廢棄或重新填裝。 | | |
| | 新柱接到儀器上后，柱頭漏液。 | 柱接頭與儀器之間連接管的壓環(huán)變形量不夠。 | 用扳手順時(shí)針?lè)较驍Q緊1／4圈直到不漏液為止。 | | |
| | 新柱接到儀器上后，啟動(dòng)儀器沒(méi)有柱壓降。 | 柱放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)柱內(nèi)充裝的液體己揮發(fā)干。 | 繼續(xù)開泵，用流動(dòng)相將柱內(nèi)氣體置換掉。 | | |
| | 新柱接到儀器上后，檢測(cè)器出口不斷有小氣泡出 現(xiàn)。 | ①同上。 ② 流動(dòng)相脫氣不*特別是MeOH／H20體系由于氫鍵作用很容易出現(xiàn)氣泡。 | ①同上。 ②配好流動(dòng)相后一定要進(jìn)行脫氣處理。 | | |
| | 新柱接到儀器上后柱壓降不斷增加，甚至超過(guò)儀器的耐壓限。 | 柱入口濾片被固體顆粒堵塞（或被毒 菌堵塞）。 | 更換或清洗柱入口濾片；用0．45µm過(guò)濾膜過(guò)濾流動(dòng)相除去微小顆粒物。 | | |
| | 進(jìn)樣次數(shù)增加柱壓降逐漸增加。 | ①樣品中含有不溶于流動(dòng)相的微小顆粒物。 ②樣品在流動(dòng)相中析出微小結(jié)晶。 | ①用0．45µm過(guò)濾膜過(guò)濾樣品。 ②推薦使用流動(dòng)相溶解樣品。 | | |
| | 使用—段時(shí)間后，柱效下降，分離不好。 | ①柱填料被流動(dòng)相溶解而流失。 ②柱填料被樣品雜質(zhì)污染。 | ①推薦使用予柱。如柱床層塌陷，用相同型號(hào)填料填補(bǔ)。 ②推薦使用保護(hù)柱或用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱除去污染雜質(zhì)。 | | |
| | 柱使用一段時(shí)間后，柱效下降出現(xiàn)雙峰。 | 柱入口床層被污染使柱填料變質(zhì)。 | 用強(qiáng)溶劑沖洗除去雜質(zhì)。 | | |
| | 柱使用—段時(shí)間后，柱效下降，出現(xiàn)峰拖尾。 | 柱入口床層被污染。 | 用強(qiáng)溶劑沖洗20-30ml，若效果不明顯應(yīng)廢棄。 | | |
| | 進(jìn)樣量增大與峰面積增加不成正比．即進(jìn)樣量與峰面積不是線性關(guān)系。 | 樣品在流動(dòng)相中的溶解度小，只有部分樣品被流動(dòng)相沖如色譜柱中而另一部分則沉積在柱人口端。 | ①用流動(dòng)相溶解樣品。 ②樣品的濃度不宜太大。 ④進(jìn)樣量不宜過(guò)大。 | | |
| | 使用緩沖液作流動(dòng)相時(shí)，柱壓降升高很快。 | 霉菌生長(zhǎng)所致。 | ①在流動(dòng)相中加入有毒物質(zhì)或加疊氯化鈉防止霉菌生長(zhǎng)。 ②實(shí)驗(yàn)結(jié)束后先用純水后用MeOH各沖洗20-30ml后關(guān)機(jī)。 | | |
| | 用5µm顆粒填料柱時(shí)， 以MeOH／H20作流動(dòng)相柱壓較高。 | MeOH與水之間由于氫鍵作用黏度增大。 | 可用乙腈／水體系使柱壓降低，分離效率更好。 | | |
| | 長(zhǎng)時(shí)間放置的色譜柱，出現(xiàn)雙峰。 | 柱床層出現(xiàn)干裂。 | 柱放置時(shí)，使用相應(yīng)的溶劑充填好，防止受大的機(jī)械震動(dòng)，如床層干裂應(yīng)廢棄掉。 | | |
| | 流動(dòng)相洗滌強(qiáng)度由弱漸強(qiáng)時(shí)出現(xiàn)很多雜質(zhì)峰。 | 強(qiáng)溶劑將弱溶劑洗不出的雜質(zhì)沖出來(lái)。 | 不影響柱的性能。 | | |
| | 柱使用一段時(shí)間后保留值逐漸縮短。 | 柱中固定相流失所致。 | ①更換色譜柱。 ②檢查所用的色譜條件是否合適。 | | |
| | 在U V色譜圖中，靠近死時(shí)間處出現(xiàn)負(fù)峰。 | ①進(jìn)樣時(shí)壓力波動(dòng)所致。 ②樣品溶劑比流動(dòng)相的UV吸收值低。 | ①采用閥進(jìn)樣。 ②用流動(dòng)相溶解樣品。 | | |
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